摘要：中国传统白酒是独特的天然固态发酵与蒸馏的产物。首次在国际上检测并鉴定了传统白酒中的非挥发性脂肽类化合物。脂肽化合物能够与白酒中的小分子风味物质发生分子间相互作用，影响风味物质的挥发和白酒的风味特征。脂肽化合物的抗菌生物活性能够天然防治传统白酒发酵过程中的不良微生物污染，对稳定白酒发酵微生物群落结构与功能有重要作用。综述了中国传统白酒中脂肽化合物的发现、产生机制和生物活性。

　　关键词：传统白酒；董酒；脂肽类化合物；白酒风味；生物活性

　　1脂肽化合物概述

　　天然环境中的芽孢杆菌能够通过非核糖体合成途径（NRPS）合成一类由长链脂肪酸（C12—C17）和寡肽（7—10肽）经内酯键/内酰胺键连接起来的环状脂肽化合物，包括surfactin家族（含lichenysin）、Iturin家族、Fengycin家族和Kurstakin家族。脂肽化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、降胆固醇的药用功效以及优越的表面活性功能，在化妆品、医药、乳化剂、保湿剂、精细化工中有着广泛的应用前景。

　　脂肽类化合物是一类酸性物质，易溶于碱性溶液、有机溶剂，包括甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和乙酸，不溶于水、石油酯、己烷等。脂肽类化合物的晶体为浅黄色的薄片，类似非结晶型残渣，表现出类似石榴的馊酸香气。这一性质，有利于表面活性素在酸性溶液中的溶解。脂肽类化合物具有超高性能的表面活性，可以将水的表面张力从70mN/m降低至27mN/m，临界胶束浓度为15.6mg/L。这一性能，有利于小分子挥发性化合物从液体表面挥发。脂肽化合物结构稳定，能够在高温（100℃、1h，121℃、10min）、高盐（6%Na-Cl）、广谱pH值范围（pH5～13）内保持稳定的活性与功能。

　　2中国传统白酒中的脂肽化合物

　　在过去的研究中，鉴于其蒸馏酒的特点，常规认为中国传统白酒中不含有非挥发性物质。但是，与国外液态蒸馏酒不同，中国传统白酒属于固态蒸馏酒，固态蒸馏的方式使得传统白酒中可能存在一定的非挥发性物质。江南大学张荣等对白酒中的不挥发物质展开了系统研究，采用SPE-LC-MS与NMR等多谱学结合的方法，首次从中国传统白酒中分离鉴定了一种芽孢杆菌非核糖体合成多肽地衣素（lichenysin）。在蒸馏酒中检测到非挥发的脂肽化合物lichenysin系国际首发，这一重要研究结果发表在国际食品领域的权威期刊《JournalofAgricultureandFoodChemistry》和《JournalofFoodScience》。江南大学从香型各异的中国传统白酒中选取15个典型代表酒样检测其中的地衣素含量。采用液质联用多反应监测方法（MRM）对不同白酒中地衣素的含量进行定量分析，结果见表1。

　　表1中国传统白酒主要香型成品酒中地衣素的含量(μg/L,n=3)

　　从表1可看出，不同白酒中地衣素含量差异很大，在0.01～111.74μg/L之间。浓香、清香、老白干、凤香、兼香、芝麻香、豉香以及部分酱香型白酒中的地衣素含量均低于1μg/L，而部分酱香型白酒以及董香型董酒中的地衣素含量都较高，其中董酒中地衣素含量远远高于其他酒，达到111.74μg/L。

　　Lichenysin具有双亲活性，能够同时与极性和非极性白酒风味组分发生相互作用，因此推测白酒中非挥发组分lichenysin可能对白酒的风格特征产生了影响，推测的作用模式为：（1）潜在的呈味物质，构成了白酒口感的丰富性和复杂性；（2）与挥发性物质产生相互作用，调节挥发性物质的挥发性能，改变并协调白酒的香气结构，如对放香强度与香气持久性产生调节作用；（3）独特和重要的生物活性功能和效果。

　　3地衣素的生物合成过程

　　地衣素是由7位氨基酸多肽和羟基脂肪酸形成的环脂肽化合物。典型的lichenysin多肽氨基酸序列为Gln-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Ile，其中3位和6位亮氨酸为D型氨基酸；长链脂肪酸的链长一般为C12—C15，且存在支链脂肪酸侧链。大部分地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）能够通过非核糖体合成途径产生地衣素。地衣芽孢杆菌是传统白酒生产中的重要微生物。非核糖体多肽合成酶是一套由多个模块组成的多酶复合体系。地衣素合成酶由LicA、LicB、LicC3个模块组成。前两个模块分别负责3个氨基酸的组装，第3个模块仅负责一个氨基酸组装。在模块1、模块2的末端存在氨基酸异构酶，形成D-Leu。在第3个模块的末端还有一个硫酯酶TE，负责lichenysin的环化和产物从多酶复合体上的释放。

　　由于lichenysin的结构与芽孢杆菌另外一种非核糖体合成多肽surfactin非常相似，仅在肽环的1位氨基酸处发生变异。Lichenysin的1位氨基酸为谷氨酰胺，而surfactin的1位氨基酸则为谷氨酸。因此，研究者推测lichenysin的合成过程应该与surfactin相似，是由群集效应诱导的多重级联反应。作为细胞密度信号分子的芽孢杆菌信息素ComX随细胞生长而浓度增加，当其浓度达到一定阈值时，诱导细胞膜组氨酸激酶ComP的自磷酸化。磷酸化的ComP将磷酸基团移至调控子ComA，使ComA完成磷酸化。ComA-P与lichenysin合成酶基因的启动子区域结合，激活RNA聚合酶的活力，使合成酶基因开始转录，启动lichenysin的合成。地衣素的非核糖体合成过程见图1。

　　芽孢杆菌是白酒发酵过程的优势细菌，数量大、种类多。本课题组发现，绝大多数白酒发酵芽孢杆菌具有合成lichenysin和surfactin能力，部分芽孢杆菌还具有iturin和fengycin合成能力（未发表数据）。白酒芽孢杆菌合成不同种类、数量的脂肽类物质可能是其长期天然驯化的过程。脂肽物质最重要的生物活性表现为界面活性和抗菌活性。具有界面活性使其能够在固态蒸馏过程中进入酒体，调节白酒的风味特征；而具有抗菌活性使芽孢杆菌能够维持在白酒发酵中的优势种群地位，抵御外界不良微生物入侵，维持白酒发酵正常的微生物群落结构，使发酵过程能够天然有序进行。

　　图1地衣素的非核糖体合成过程

　　4脂肽的生理功效与应用

　　4.1地衣素选择性影响白酒中香气化合物的挥发性

　　为了明晰白酒中非挥发脂肽地衣素对白酒风味的贡献，本课题组采用HS-SPME-GC-MS方法研究了地衣素对3种重要香型白酒（酱香型、浓香型和清香型）中香气化合物挥发性的影响。结果发现，在添加160μg/L地衣素到酒样中时，检测到的样品中香气化合物的含量变化不同。地衣素对短链酯的影响并不显著，3种酒中短链酯的挥发浓度一般降低1%～15%，例如，乳酸乙酯在酱香型白酒中显著降低12%(p≤0.05)。在长链酯中，癸酸乙酯的检测值在酱香型和浓香型白酒中显著降低14%～15%(p≤0.05)，辛酸乙酯在清香型白酒中显著降低18%(p≤0.05)。地衣素对醇和醛的抑制最多，为1%～8%。至于酸类化合物，酱香型白酒中己酸的检测值显著降低50%(p≤0.05)，浓香型白酒中己酸降低12%。浓香型白酒中己酸含量高达1～2g/L，中国传统白酒中地衣素的含量范围为0.01～111.74μg/L，这可能导致在浓香型白酒中地衣素的含量不足以显著降低己酸的挥发性。

　　4.2地衣素对白酒中异味苯酚类化合物挥发性的影响

　　地衣素与芳香族和酚类化合物之间的作用最为显著。3种白酒中2-苯乙醇、苯酚和4-甲基苯酚的检测值分别显著降低58%、76%和59%(p≤0.05)。这可能是由于酚羟基与地衣素的羧基形成氢键作用力影响着香气化合物的挥发性。因此，地衣素选择性的影响着白酒中香气化合物的挥发性。

　　挥发性酚类物质被认定为白酒中的异味物质，其中4-甲基苯酚和4-乙基愈创木酚分别表现出马厩味和焦味。江南大学通过风味化学研究和NMR波谱研究在国际上首次发现地衣素通过分子间作用力与白酒中的异味酚类化合物发生相互作用。这一重要研究成果发表在顶级期刊《JournalofAgricultureandFoodChemistry》上。地衣素可以显著降低模拟酒体系中苯酚类化合物的挥发浓度，地衣素发挥作用的最显著浓度为160μg/L（表2）。此时，苯酚、4-甲基苯酚和4-乙基苯酚的挥发浓度分别降低了39%、45%和48%(p＜0.05)。另外，愈创木酚和4-乙基愈创木酚的挥发浓度分别降低了30%和45%(p＜0.05)。随着模拟体系中地衣素浓度的增加，其对苯酚类化合物挥发性影响趋于平衡。当地衣素的浓度为16μg/L，苯酚类化合物的挥发性降低了17%～22%。

　　表2添加地衣素对模拟体系中苯酚类化合物的香气强度影响

　　注：不同字母表示显著性p≤0.05，n=10。

　　热力学实验表明，4-乙基苯酚、愈创木酚和4-乙基愈创木酚与地衣素存在氢键或者范德华作用力。苯酚和4-甲基苯酚与地衣素之间存在疏水相互作用，苯酚的1H可能与地衣素的氨基酸残基形成氢键作用力。采用1HNMR和2DNOESY分析地衣素与酚类化合物的结合位点，发现它们之间的氢键作用表现在地衣素中缬氨酸的羧酸氧和4-乙基愈创木酚的酚羟基。地衣素与白酒中的异味酚类化合物之间的分子相互作用，对于减少白酒不良风味的挥发具有重要意义。

　　4.3表面活性素等脂肽化合物对白酒异味geosmin的生物防治作用

　　中国传统白酒酿造是一个天然开放的固态发酵过程，因此无论是制曲还是酒醅发酵过程都可能被环境中的不良微生物污染。例如，环境中的链霉菌可能在制曲阶段被引入发酵过程。链霉菌合成geosmin，并随着制曲、发酵、蒸馏过程最终被带入酒中，使白酒呈现不愉快的土臭异味。进一步研究表明，产geosmin的链霉菌同时还产生大环类脂抗生素，影响功能性酵母的生长代谢，降低发酵性能和出酒率。由于大曲是一个复杂的生态系统，其中功能微生物和潜在的腐败微生物的生长环境，对营养和生存条件的需求基本相同，因此难以对其进行有效控制。

　　江南大学研究了一种新型的“以菌治菌”的方法，巧妙地利用大曲中产抗菌脂肽的芽孢杆菌控制白酒发酵过程链霉菌污染。从高温大曲中筛选到的枯草芽孢杆菌菌株2-16和解淀粉芽孢杆菌菌株1-45能够有效抑制产geosmin链霉菌的生长。在芽孢杆菌与链霉菌共培养过程中，链霉菌的生长受到显著抑制，而geosmin的合成则完全被抑制，说明营养和生长空间竞争是芽孢杆菌抑制链霉菌生长的原因之一。此外，2-16能够合成surfactin和fengycin类抗生素，1-45能合成surfactin和bacillomycinD类抗生素。多种脂肽协同发挥抗菌作用，能够完全抑制S.sampsonii的生长和geosmin合成。该重要发现已发表在食品微生物领域国际顶级期刊《InternationalJournalofFoodMicrobiology》，并已被7次引用。产脂肽的芽孢杆菌能够有效防治不良微生物污染而对功能酿造酵母、霉菌的生长无影响，说明白酒芽孢杆菌合成特异性杀灭不良白酒污染菌的特性是白酒天然发酵不断进化的结果，这一功能稳定了白酒天然发酵微生物体系的正常结构和功能，维持了白酒天然发酵的正常有序进行。

　　此外，由于芽孢杆菌具有优越的脂肽抗生素合成能力，已被应用于多种食品及农产品的生物防治中。例如，Cho等从韩国发酵调味料kanjang中分离出1株能够抑制产黄曲霉毒素霉菌生长的BacilluspumilusHY1，MALDI-TOFMS检测到该菌株能够产生分子量为1043、1057、1071的脂肽化合物iturin，从而抑制发酵豆制品中的产黄曲霉毒素污染菌Aspergillusflavus和Aspergillusparasiticus。Kim等从土壤中分离得到1株能够产surfactin，fengycin和iturinA的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCMB32，该菌株对因Colletotrichumgloeosporioides引起的棉花炭疽病有潜在的生物防治功能。Ph.Jacques等采用分子生物学快速PCR鉴定的方法从非洲的发酵食品中分离到了产surfactin的芽孢杆菌，并提出食品中存在的天然浓度的surfactin低毒性且对人体无害。Compaoré等从非洲的发酵食品中分离到1株芽孢杆菌Bacillussubtilissubsp.SubtilisH4，经UPLC/TOFMS鉴定该菌株能同时产生surfactin和一种新型bacteriocin，以抑制因单核李斯特菌引起的食品腐败。Kong等从海洋中分离得到1株产抗菌活性物质的Bacillusmegaterium，用于预防花生贮藏过程中的霉菌污染。此外，芽孢杆菌作为根际微生物能够刺激植物生长，抑制植物病原微生物生长的机理也逐渐清晰，其主要原因在于芽孢杆菌能够产生包括surfactin，lichenysin，fengycin，iturin在内的多种环状脂肽化合物，并在植物根际形成biofilm，作为天然壁垒有效阻止病原微生物的入侵，保障植物健康生长。

　　4.4脂肽化合物的其他生物活性

　　4.4.1抗癌活性

　　有研究表明，surfactin能够通过诱导细胞凋亡来实现对乳腺癌肿瘤细胞的抑制，实现抗癌作用。Surfactin通过促进p53蛋白的表达，导致下游的CKI（p21）(周期蛋白依赖性激酶抑制因子)表达增加，最终对cdc2（细胞分裂周期蛋白）和cyclinB1（周期素B1）的表达产生抑制作用，使肿瘤细胞不能通过G2/M期，不能进行有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞增殖。另一方面，surfactin诱导微管蛋白的解聚和重排，使细胞骨架发生剧烈变化，从而使细胞分裂停滞在G2/M期。此外，Yin等发现，fengycin能够通过活性氧产生和线粒体依赖的细胞凋亡抑制人肺癌细胞的扩增。Surfactin与fengycin的抗癌活性为中国传统白酒的健康保健功能提供了新的理论依据。

　　4.4.2抗病毒活性

　　研究表明，地衣素等脂肽化合物呈现出一定的抗病毒活性。地衣素不仅能够瓦解包被病毒的油脂层，而且能够通过形成离子通道破坏病毒的衣壳。研究表明，表面活性素具有抗HIV和HSV病毒的活性。

　　4.4.3溶纤活性

　　血纤维蛋白fibrin是一种蛋白质，由凝血酶作用于血纤维蛋白原而形成的，血纤维蛋白聚合而成血凝块。血纤维蛋白分为可溶的单体形式和不溶的多聚体形式，影响人类健康。早在1968年，研究者就发现枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物surfactin能够抑制血纤维蛋白凝块，具有溶纤活性。

　　4.4.4抑菌活性

　　地衣素的双亲活性使其能够渗透所有类型细菌的细胞膜，是自然界中非常重要的抗菌肽。细菌主要分为两种类型，分别是革兰氏阴性和革兰氏阳性，两种类型细菌的膜构成不同。革兰氏阴性细菌的细胞膜由外面的脂多糖和磷脂双分子层及稀薄的肽聚糖组成；而革兰氏阳性细菌的细胞膜缺乏外面的脂多糖并且运载更加厚实的肽聚糖和磷脂双分子层。这就有利于地衣素创造一个有渗透性的环境并破坏细胞膜。一般地衣素浓度达到12～50μg/mL能够有效起到抗菌作用，这就是最低抑制浓度(MIC)。

　　有研究表明，脂肽物质的抑菌功能主要是通过破坏细胞膜的完整性来实现，表现出显著的抗细菌活性。Deleu等通过人工材料DOPC和DPPC模拟细胞膜，考察不同浓度surfactin处理不同时间对细胞膜的作用。结果表明，surfactin能同时与模拟细胞膜的极性头部和非极性尾巴相互作用。当surfactin的浓度低于CMC（临界成胶束浓度）时，surfactin从生物膜的边界部位插入生物膜的极性与非极性组分之间，阻止两相分离，加固生物膜结构；当surfactin的浓度处于CMC附近时，surfactin能够溶解可流动性磷脂部分，并增强脂质双分子层其余部分的有序性；当surfactin的浓度高于CMC时，磷脂与刚性脂质双分子层与surfactin形成大小不同的混合胶束，彻底破坏细胞膜结构。

　　BacullomycinD和fengycin则表现出显著的抗真菌作用，具体抑菌机理尚不清晰，推测可能是与细胞膜表面的甾醇结合破坏细胞完整性，从而抑制真菌的生长。

　　5结论

　　传统白酒中的地衣素等脂肽类化合物对白酒的风味具有重要贡献。产脂肽微生物对稳定白酒发酵过程中微生物群落结构与功能有重要作用。同时脂肽类化合物的独特而丰富的生物活性功能也对中国传统白酒的健康保健功能有重要贡献。【壹酒购】